Published: Apr 14, 2021
将一个蛋白质分割为两个片段还能恢复功能吗？分裂蛋白是合成生物学里调控蛋白质功能或构建逻辑门元件的重要策略。然而，如何预测分裂蛋白质片段难以捉摸的重组织能力，以及如何寻找合适的分裂位点，一直是构造分裂蛋白的关键问题。解决上述问题的策略主要有两种，一种是根据蛋白质结构和相应模型进行理性设计，一种是采用定向进化的方法进行暴力破解。
近日，爱丁堡大学的王宝俊团队在Nature Communications发表了题为A systematic approach to inserting split inteins for Boolean logic gate engineering and basal activity reduction 的文章（Trevor Ho为第一作者）。通过改造噬菌体转座子和蛋白内含肽，研究团队开发出了一种新型定向进化方法，从而能够简便地扫描和筛选合适的蛋白质分裂功能位点。
这种被命名为IBM (intein-assisted bisection mapping）的方法将蛋白质剪接片段内含肽与噬菌体转座子联合使用，各取其长。前者最大限度地确保了分裂蛋白的重组织和功能性，后者则使得目标蛋白的潜在分裂位点能被全覆盖筛选。
研究者使用转座子在蛋白质的编码序列中随机插入一个分裂点标记，进而构建出一个由标记点位置各异的DNA片段组成的文库。随后通过一个序列插入步骤，研究者得以一步将文库中的线路全部转变为可受双诱导物控制的分裂蛋白发生器（图1）。通过对文库进行表征和筛选，科学家得以找到有效的蛋白分裂位点。同时，这种分裂蛋白上自带内涵肽片段，因此可以高效地重组织成有稳定功能的完整蛋白。
IBM不仅适用于转录调控蛋白，也适用于Sigma因子和荧光蛋白等其它具有可筛选输出功能的任意蛋白，可以对目标蛋白上所有潜在的分裂位点进行扫描，从而快速挖掘出新型”与”门和”与非”门等模块化基因表达逻辑控制器件。
除了用于制造蛋白逻辑门元件，IBM还可以用于优化基因表达调控装置的动力学特征。
对于泄漏表达水平高、输出变化范围小的诱导型启动子，IBM可以将转录调控蛋白从“完整蛋白”模式转变为“分裂-重组”模式，从而极大抑制相应转录调控蛋白的基础活性及泄漏转录水平，从而提高输出的动力学变化范围。图2分别展示了IBM在显著降低三种不同蛋白（β-lacatamase，TetR， ECF20）的本底表达水平及提高相应输出动态范围的高效能力。
在应用层面，当与诱导型内涵肽结合，IBM可以同时构建和优化基于蛋白的新型生物传感器。研究团队通过这种策略，轻松开发了咖啡因诱导的细菌Sigma因子。
IBM通过新颖的设计降低了分裂蛋白定向进化拆分策略的复杂性，将“地毯式”扫描拆分位点和融合蛋白设计结合起来，并提出和展示了多种不同应用场景，为合成和化学生物学提供了一种高效的新型蛋白功能定向进化工具，具有广阔应用前景。
