Published: Jan 02, 2025
细胞需要时刻收集、处理和记忆来自周围环境的各种各样的信号（如pH、温度、群体感应分子等），来调节自身的生命活动和生存状态。如何精准地操控细胞的信号处理过程，使细胞按照用户设定的逻辑执行特定的功能，是合成生物学研究中的一个关键问题。合成生物学家通过构建生物计算基因线路，对细胞信号处理过程进行重新编程，在环境监测、疾病检测治疗、代谢工程等领域取得了广泛应用。然而，目前大多数生物计算线路的规模和复杂度仍然比较有限，主要是受到两方面因素的制约：正交基因元件缺乏和基因线路创建效率较低。
近日，浙江大学王宝俊团队在Nature Chemical Biology上发表了题为“Programmable trans-splicing riboregulators for complex cellular logic computation”的研究文章（高元力为第一作者）。该研究开发了一类基于断裂内含子反式剪接的基因调控技术（SENTR），通过调节第一类内含子的反式剪接活性，在RNA水平实现了可编程、可预测、模块化且正交的基因表达调控。随后，研究团队将SENTR工具应用于活细胞内的RNA检测和RNA逻辑计算，并提出了断裂内含子和断裂内含肽相结合的生物分子剪接复合线路设计方法，可以大幅提高单个转录因子的信息处理能力，在活细菌中成功实现了可以处理多达6个输入信号的复杂逻辑计算。
基因元件是搭建基因线路的“积木”，因此基因元件的质量和数量在基因线路的大规模创建中至关重要。研究团队发现第一类内含子（Group I intron）具有非常适合工程化改造的特征，有被开发为高质量基因元件的巨大潜力：第一，第一类内含子具有自我催化活性，可以介导顺式剪接反应，把自身从前体RNA中剪切并把两端外显子连接产生成熟的mRNA分子；第二，第一类内含子广泛分布于细菌、病毒、动植物中，并在多种模式底盘中都具有剪接活性；第三，第一类内含子可以实现反式剪接，即内含子可以在茎环区域断裂，从而将前体RNA拆分成两条RNA链（5’ RNA和3’ RNA），使其只有同时表达时才能组装成完整内含子进行RNA剪接。
开发基于内含子的调控元件的第一步是实现高效可控的RNA剪接。为此，研究团队设想能否通过设计互补配对的RNA结合域（EGS）作为“分子胶水”，来协助断裂内含子的组装，进而提高目的基因的反式剪接活性（图2a）。目的基因转录出的5’ RNA和3’ RNA只有同时存在并发生剪接后才能形成完整的mRNA，成功表达出目的蛋白（图2b）。通过改变EGS的序列，可以对目的基因的反式剪接活性进行调节，实现连续可变的动态范围（从10倍到高于1000倍）（图2c）。研究团队随后采用大规模表征结合机器学习模型，实现了从EGS序列到内含子反式剪接活性的预测（图2d）。
正交性是衡量基因元件质量的一项重要指标，它指多个元件同时使用时，相互之间互不干扰的能力。研究团队在多个组分水平（EGS，P1，内含子断裂位点，内含子种类）分别开发了正交的内含子元件（图3）。研究团队首先通过热力学模拟设计了24对正交的EGS序列，使其相互之间难以结合造成串扰（图3a-c），随后探索了不同P1序列（决定剪接位点的序列）和内含子断裂位点对剪接活性和正交性的影响（图3d-i）。研究团队继而改造并表征了17种新型内含子，并从中发掘到8对具有高活性且正交的断裂内含子，建立了目前最大的正交内含子文库（图3j-l）。
研究团队随后对RNA反式剪接系统的灵活性、稳健性以及应用进行了进一步的探索。在之前的研究中，断裂内含子的剪接位点一般局限在尿嘧啶（U），而研究团队首次报道了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)也能作为剪接位点，大大扩展了剪接位点的序列空间和应用潜力（图4a）。此外，断裂内含子在多个转录因子中均可以稳健地行使调控功能（图4b）。通过将断裂内含子插入基因的5’ 非翻译区，研究团队实现了模块化的RNA剪接调控，其在替换不同的下游报告基因后，均可保持相似的调控功能（图4c,d）。研究团队进一步展示断裂内含子可以用来调控CRISPR系统中sgRNA的活性（图4e），并用于监测胞内表达的编码抗生素抗性蛋白的mRNA（图4f）。
在获得高质量基因调控元件之后，研究团队尝试构建了基于断裂内含子的布尔逻辑计算线路。布尔逻辑计算线路可以根据输入信号0和1的不同组合，生成输出信号为0或1。研究团队通过设计RNA相互作用，构建了不同的双输入布尔逻辑计算线路，包括与门、与非门、蕴涵门、蕴涵非门、或门、或非门（图4b,图5a-c）。通过在目标基因中插入多对断裂内含子，研究团队将转录激活因子ECF20的 mRNA拆分成三段或四段，再利用多个反式剪接反应将其连接成完整的mRNA，成功构建了三输入与门和四输入与门（图5d,e）。
针对目前基因线路创建效率较低的难题，研究团队开发了一种新型的基因线路设计策略：基于内含子和内含肽耦合的生物分子剪接线路设计策略。此策略中，断裂内含子和断裂内含肽分别催化RNA层面和蛋白质层面的分子剪接，输入RNA分子经过两次剪接后形成具有功能的转录因子。使用这种策略对转录因子进行拆分，研究团队成功使用单个转录因子，构建了四输入与门、四输入与非门和六输入与门 (图6)。该六输入与门是目前最为复杂的与门电路；与传统的级联转录因子策略相比，前者需要十个转录因子才能实现类似的功能，故研究团队提出的新型设计策略可以将单个转录因子的信息处理能力提高10倍。
综上所述，这项研究围绕当前高质量基因元件匮乏和基因线路创建效率过低的难题，开发了基于断裂内含子剪接的新型基因调控技术和元件，并提出了基于断裂生物分子剪接的复杂基因线路设计策略。研究中开发的内含子元件在RNA检测、RNA环化以及RNA疗法等领域有诸多潜在应用，而基于内含子和内含肽的基因线路设计策略可以大幅提高单个转录因子的信息处理能力和逻辑计算线路的复杂度，将为复杂基因线路设计提供新的范式。
论文信息
Gao Y, Mardian R, Ma J, Li Y, French C and Wang B*, “Programmable trans-splicing riboregulators for complex cellular logic computation”, Nature Chemical Biology, 2025. doi
